希腊女神发型【综述】李斯特菌溯源分析方法及应用进展-中华内科杂志

【综述】李斯特菌溯源分析方法及应用进展-中华内科杂志

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本文刊于：中华内科杂志, 2018,57(11) : 850-852
作者：范张玲 王焕玲
单位：中国医学科学院 北京协和医学院
单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，以下简称李斯特菌）为革兰阳性、兼性胞内寄生菌，广泛存在于自然界中，主要通过食物传播给人导致李斯特菌病[1]。当食入李斯特菌污染的食品后可导致腹泻、腹痛等消化道症状；发生侵袭性感染时细菌可穿过肠道上皮细胞入血，导致菌血症、脑膜炎等；妊娠妇女感染可导致流产、早产及新生儿感染等严重并发症。老人、孕妇及免疫力低下者为李斯特菌感染高危人群[2]。在美国由李斯特菌病导致的病死率占食源性疾病的19%，平均每年用于李斯特菌病的医疗花费及该病所致经济损失达28亿美元[3]。
目前已有报道李斯特菌可污染卷心菜、奶酪、核果类食物、肉食、冰激凌、香瓜、苹果等多种食物，引起李斯特菌病的暴发流行[4]。李斯特菌病潜伏期长[3]，对锁定可疑食物造成困难，且其生存能力强，耐低温环境，使其在低温储藏食物中流行尤为广泛。李斯特菌对青霉素等抗菌药物多敏感且治疗有效[5]，但临床病死率仍较高，可能与高龄、新生儿、免疫功能低下人群感染且李斯特菌病发病多较重[2]以及临床不能及时诊断、正确用药有关。因此，结合实验室分型方法和流行病学资料，对临床李斯特菌感染株进行同源性分析，尽快溯源污染食物减少新发致病，从源头上根除食物污染，预防再次污染发生，具有极其重要的临床和流行病学意义。以下对李斯特菌溯源分析方法做一综述，尤其对近年新出现的基因测序方法及应用进行重点介绍。
一、1980—1998年不同实验室使用各自不同的分型方法进行菌株同源性分析
1．血清学方法：
传统的血清学方法根据李斯特菌鞭毛抗原和菌体抗原的不同，将李斯特菌分为13个血清型，但由于该方法结果可靠性存在争议等，逐渐被分子血清分型方法取代，即根据李斯特菌基因位点的差异，将13个血清型分为5个血清组[6]。与人李斯特菌感染相关的血清型几乎均为1/2a、1/2b、1/2c和4b，以1/2a和4b型为主[7,8,9]逆脉天骄 ，李斯特菌病的暴发流行多与4b相关[10]。我国报道的以4b和1/2b为主[11,12]。1983年在美国的一起李斯特菌病暴发案例中，分离自患者的菌株血清型均为4b型；流行病学调查发现，多数患者对某牛奶有接触史，对其进行李斯特菌检测发现了与流行菌株相同的4b型李斯特菌，从而实现溯源[13]。
2．核糖体分型：
该方法使用限制性内切酶（EcoRI）将细菌DNA剪切，不同长度的DNA片段经电泳得到分离形成图谱，不同的图谱即为不同的核糖体型别魔界生死棋 。Jeffers等[14]联合核糖体分型和act、hly毒力基因对分离自人（119株）和动物（76株）的李斯特菌进行分型，核糖体分型方法对人李斯特菌分辨率为0.857，而联合hly和act等位基因后其分辨率为0.904；此外联合核糖体分型和毒力基因可将李斯特菌分为3个进化枝（lineage），lineage Ⅲ在临床分离株中的比例很少（0.8%），而92.9%的人暴发菌株以及62.9%的人散发菌株为lineage Ⅰ，提示李斯特菌在人群中的不同易感性很可能与其毒力不同或耐逆境能力不同有关。
此外其他分型方法如多位点酶电泳、肠杆菌基因间保守重复序列-聚合酶链反应、随机扩增多态性DNA标记等方法也有报道用于李斯特菌实验室同源性分析，均具有一定的分型能力[15]。
二、1998年脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）技术曾被定为同源性分析金标准
PFGE技术将细菌染色体DNA大片段的长度多态性分析、PFGE、计算机技术进行有机整和，较前述分型方法在分辨率方面表现出明显优势，1998年美国疾病预防控制中心（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）宣布将该方法定为李斯特菌同源性分析金标准[3,4]，并建立食源性疾病监测国家分子分型网络体系（PulseNet），资源通过网络可实现共享[16]。1996年至2003年美国李斯特菌病病例降低了24%，妊娠相关病例降低了37%[17]。
2004年，美国CDC在基于PFGE方法监测体系基础上，增加李斯特菌行动计划（Listeriainitiative），即在确定李斯特菌感染的第一时间给患者填写一份包含40多种食物接触史的调查问卷，分析锁定可疑食物，配合PFGE分型方法，尽快溯源传染源[18]，溯源成功率明显升高[3]。葡萄牙等国家于2010年开始实施李斯特菌行动计划，在2009—2011年的暴发调查中，18例4b血清型菌株的PFGE图谱相似，提示具有同源性，对相应患者的调查问卷进行分析锁定了4种可疑食物，进一步进行PFGE同源性分析提出奶酪为传染源，并提出食品间存在交叉污染[19]。
但PFGE方法仅根据细菌的核酸片段进行分型，使得其分辨率有限，此外PFGE指纹图谱没有统一学术名称，其结果无法在实验室间进行充分比对共享[3,20]。
三、新近基因测序技术的应用
1．多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）：
该方法通过提取细菌的DNA后，根据MLST数据库所提供的引物，设计PCR，扩增出李斯特菌7个保守性高的管家基因并对其测序牛玉强 ，根据7个管家基因型确定相应的ST型别，从而对菌株进行分型[21]。亦有报道根据李斯特菌毒力基因的不同，以毒力基因为靶位点进行多毒力位点序列分型的方法[22]。目前报道的人李斯特菌MLST型别有多种，意大利ST38、ST1、ST8稍为多见（约占35%）[9]；我国ST87、ST3、ST7略多[12]。Maury等[7]根据李斯特菌MLST型别间基因的差异，将存在单个位点变异的菌株称为克隆复合物（clone complexes, CCs），发现在所有来自临床和食物中的菌株中，各类克隆复合物所占比例不同无翼蝙蝠，CC1、CC2、CC4、CC6在临床中分离率（62%）较高，但CC121、CC9虽在临床分离株的比例较低（10.3%），但在食物中的分离率较高；这与前述Jeffers等[14]的结果相似，虽是根据不同的分类方法对李斯特菌进行分型，但是均发现在人和动物、食物中的流行李斯特菌群不同，提示不同菌株其致病力可能不同。
MLST操作简单，结果精确，结果可在各实验室间共享毛昱衡，多被用于李斯特菌流行现状的调查以及菌株间进化关系的推断[15,23,24,25]，但其方法学上仅参考了细菌基因组内7个管家基因的差异文山睡懒觉，在分析菌株间同源性的分辨率上与PFGE方法相比并未表现出明显优势[1]。
2．全基因组测序：
全基因组测序技术对菌株的全基因组进行测序，分析单核苷酸多态性的差异，从而推断菌株间同源性，使得李斯特菌同源性研究的分辨率达到最大化。2014年丹麦的一起李斯特菌病暴发流行中，共有41例李斯特菌病患者，死亡17例，Kvistholm等[26]对分离自患者的李斯特菌进行全基因组测序，经比对菌株间单核苷酸多态性位点≤3个，确定其具有同源性，进而对患者进行流行病学调查，对可疑污染源进行锁定，发现分离自某公司的肉制品的菌株和暴发菌株测序结果相同，从而锁定其为传染源。
2013年，美国开展了多中心实时李斯特菌基因测序方法，基于菌株的全基因组水平的4 804个基因进行测序，将所有分离自患者的李斯特菌测序结果提交至PulseNet网站多花指甲兰，当从食物或者环境中检测到李斯特菌后进行基因测序并将结果提交至GenomeTrakr网站，GenomeTrakr网站会自动搜索PulseNet中的基因序列结果进行比对分析，从而第一时间将外界分离的菌株基因序列与患者的进行比对，分析其同源性沙洲优黄，溯源临床分离的李斯特菌[27]赵德柱 。
2014—2015年，美国通过全基因组测序方法联合问卷调查，首次报道苹果亦可作为传染源引起李斯特菌病暴发流行，本次暴发波及12个州共35例感染者，住院率97%无比山药丸，病死率20%[28]。使用全基因组测序后，美国平均每年鉴定的暴发数明显增多，迈克尔奥赫每起暴发的平均发病例数下降，尤其是食源性相关病例的溯源李达安 ，成功率显著升高[27]。
3．核心基因组多位点序列分型方法（core genome MLST, cgMLST）：
全基因组测序鉴定菌株间同源性虽在分辨率上表现出明显优势，但价格昂贵，且较难标准化，不利于其普及，因而Moura等[29]建立了基于核心基因组水平的多位点序列分型方法cgMLST，即基于957株不同来源菌株基因组的高度保守区，选取了1 748个基因位点，并用收集好的650株菌的基因组检验其分型能力猛鬼医院，结果99.1%株菌中均可检测到所设定的1 748个基因，验证了其通用性；此外该研究收集了1 696株不同来源的李斯特菌，针对其核心基因位点进行测序，存在7个以上等位基因位点的不同定义为一个cgMLST型别，结果共将李斯特菌分为1 017个cgMLST型别，100株菌用PFGE方法被分为30个型别，而用cgMLST方法则可将菌株分为68个型别；且cgMLST方法可将同一PFGE型李斯特菌区分开，而PFGE不能将任何cgMLST型别再分型，分辨率较PFGE明显升高；此外该实验中使用cgMLST方法将李斯特菌不同进化枝区分开，并且发现lineage Ⅰ和lineage Ⅱ进化速率较慢，每年每个基因位点约有2.5 × 10-7个碱基替换，表明李斯特菌基因组相对较稳定。2015—2016年法国开展cgMLST检测用于人及食物李斯特菌常规监测[30]，且和金标准PFGE方法同时进行，结果cgMLST分辨率明显高于PFGE方法，且发现部分PFGE型别相同的菌株间无相关性肥仔球王，而不同PFGE型别菌株间却有同源菌株存在；此外，该方法可鉴定出PFGE无法鉴定的李斯特菌病暴发，以及延续时间较长的暴发，有助于早期溯源传染源高丽雯，及时防止更多人群感染。
国内已有报道对临床分离李斯特菌进行全基因组测序，旨在为后续研究建立李斯特菌基因序列标本库[31]甲苯咪唑片，但该方法尚未在国内普及，报道最多的还是PFGE方法。我国1969年首次报道李斯特菌病例至今，报道的平均每年病例数由不到1例增多至10余例，发病率呈明显上升趋势，但暴发病例报道罕见双羽四足，多为散发怒之拳，流行病学资料难以汇总分析，给国内李斯特菌溯源工作带来挑战[2,11]。如何建立符合我国国情的李斯特菌监测体系仍值得深入研究和尝试，临床病例及食物中的李斯特菌标本库的建立无疑是目前最重要任务，并根据不同实验室条件，选取合适的分型方法如全基因组测序或cgMLST等，对现有李斯特菌进行同源性分析比对，尽早溯源相关污染源希腊女神发型蒙阴龙之媒。
参考文献（略）